Ключевые слова: Цефтриаксон, Цеф III®, оригинальный препарат цефтриаксона, Минимальные ингибирующие концентрации, аэробные бактерии.

 Введение

Цефтриаксон, впервые выпущенный под торговой маркой Роцефин, является цефалоспорином третьего поколения, изобретенным в начале 1980-х годов Хоффманом-Ла Рошем. Несмотря на то, что он проявляет избирательное и необратимое ингибирование синтеза клеточной стенки бактерий как и другие β-лактамные антибиотики [1,2], было установлено, что Цефтриаксон является стабильным в присутствии широкого спектра бактериальных β-лактамаз [3]. Таким образом, среди других антибиотиков третьего поколения Цефтриаксон широко используется для лечения инфекций, вызванных антибиотикорезистентными организмами.

Цефтриаксон демонстрирует превосходную активность против многих аэробных организмов: грамположительные метициллин-чувствительные штаммы Staphylococcus aureus и коагуляза-отрицательные Staphylococci, Streptococcus pyogenes (Группа A), Streptococcus agalactiae (Группа B), Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans; и грам-отрицательные Borrelia burgdorferi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Moraxella catarrhalis, Neisseria gonorrhoea, Neisseria meningitidis, Proteus mirabilis, Providencia spp [4].

Цефтриаксон также проявляет высокую активность против Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Morganella morganii, Proteus vulgaris, Serratia marcescens, Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Peptostreptococcus spp., Clostridium perfringens. Тем не менее, чувствительность штамма должна быть проверена до введения лекарственного средства из-за увеличения числа патогенов с множественной лекарственной устойчивостью, продуцирующих β-лактамазу расширенного спектра  (ESBL) [4,5].

Список Цефтриаксон-резистентных патогенов включает Enterococcus spp., Listeria monocytogenes, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Clostridium difficile, Chlamydia spp., Chlamydophila spp., Mycoplasma spp., Legionella spp. и Ureaplasma urealyticum [4].

В качестве цефалоспорина расширенного спектра Цефтриаксон полезен для лечения ряда бактериальных инфекций, включая бактериальный менингит, внебольничную и больничную пневмонию, острый бактериальный средний отит, инфекции брюшной полости, инфекции мочевых путей, инфекции костей и суставов, кожные инфекции, гонорея и сифилис [4]. Начиная с первого выпуска Роцефина, на рынок были введены многие дженерики для того, чтобы сделать Цефтриаксон более доступным, снижая цены на продаваемые лекарственные средства и снижая расходы на общественное здравоохранение. Например, "Государственный реестр лекарственных средств, изделий медицинского назначения и медицинской техники Республики Казахстан" включает 43 препарата Цефтриаксона по состоянию на октябрь 2017 года [6]. Дженерики, содержащие те же активные ингредиенты, что и оригинальный препарат, должны проявлять ту же активность in vitro и in vivo, чтобы подтвердить свою пригодность для терапевтического применения. Цеф III® это недавно представленный на рынке дженерик Цефтриаксона, произведенный АО "Химфарм" (г. Шымкент, Республика Казахстан).

В текущем исследовании сравнивалась антибактериальная активность оригинального препарата цефтриаксона и его дженерика Цеф III® in vitro против ряда аэробных бактерий с точки зрения минимальных ингибирующих концентраций (МИК).

Материалы и методы

Исследование проводилось в соответствии с Правилами надлежащей лабораторной практики Великобритании (Законодательный акт 1999 года № 3106 с поправками, внесенными Законодательным актом 2004 года № 994), Принципами надлежащей лабораторной практики OECD (пересмотренные в 1997 году), ENV/MC/CHEM (98) 17 и Директивой Комиссии ЕС 2004/10/EC. Значения МИК были определены посредством метода микроразведений в бульоне с использованием 96-луночных планшетов, основанного на процедурах, описанных Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI) - Методы проведения тестов на определение чувствительности аэробных бактерий к антимикробным препаратам путем разведения; M07-A10 (2015) [7].

Тест-организмы

Были протестированы следующие аэробные бактерии, полученные из ATCC (Американская коллекция типовых культур, LGC Standards, Queens Road, Teddington, Мидлсекс, TW11 0LY, Англия) и NCTC (Национальная коллекция типовых культур, Общественное здравоохранение Англии, Porton Down, Солсбери, SP4 0JG, Соединенное Королевство): Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Streptococcus pneumoniae (ATCC 49619), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 41501), Haemophilus influenzae (ATCC 49247), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603, ESBL – β-лактамаза расширенного спектра) и Klebsiella pneumoniae (NCTC 7427).

Культуры тест-организма хозяина, хранящиеся в жидком азоте в Отделе клеточных и молекулярных наук (Envigo), оттаивались и использовались для приготовления исходных культур путем инкубации на трипном соевом агаре (TSA, Oxoid CM0131), Колумбийском агаре, содержащем 5% стерильную конскую кровь (Oxoid, SR0050C) для Streptococcus pneumoniae или Колумбийский шоколадный кровяной агар в 5% CO2 атмосфере для Haemophilus influenzae при температуре 35 ± 2°C в течение около 18-48 часов.

Иноакуляты тест-бактерий были получены из свежих рабочих культур, выращенных, как описано выше. Поверхностный рост собирался и суспендировался непосредственно в стерильном 0,9% физиологическом растворе, и стандартизовался для получения 30-50% световой передачи при 520 нм на спектрофотометре Jenway 6300 - приблизительный выход 5 × 108 колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл. Суспензии разбавлялись с помощью 0,9% физиологического раствора, чтобы получить примерно 106 КОЕ/мл, а затем сразу же использовались в качестве инокулята.

Тестируемые образцы

Цеф III® (АО "Химфарм", г. Шымкент, Республика Казахстан) и оригинальный препарат цефтриаксона (Швейцария, F.Hoffmann - La Roche Ltd.) были поставлены компанией VORTEX Clinical Service (Республика Казахстан). Тестируемые образцы подготавливались в растворитель, который поставлялся в комплекте с тестируемыми образцами, требуемый для клинического применения (1% раствор лидокаина гидрохлорида) при концентрации 320 мг/мл. Химический анализ подготовленных тестируемых образцов для определения стабильности, однородности и концентрации не проводился в рамках данного исследования. Дальнейшее 1 из 100 разведение каждого тестируемого образца подготавливалось с использованием стерильной дистиллированной воды для получения концентрации тестируемых образцов 3200 мкг/мл. Дальнейшие разведения подготавливались в двойных рядах на 96-луночных микротитрационных планшетах в последовательном порядке 1: 1 об./об. с использованием катионного буфера Mueller Hinton Broth (CAMHB) или HTM для штамма Haemophilus. 100 мкл раствора тестируемого образца переносились в соседнюю лунку на микротитровальном планшете, содержащем100 мкл питательной среды, и дублировались для получения (×10) концентраций тестируемого образца  200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,1, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2 и 0,1 мкг/мл.

Конечные концентрации тестируемого образца были получены путем переноса 20 мкл каждого соответствующего разведения тестируемого образца из соответствующих рядов/лунок на планшете для разведения в соответствующие ряды/лунки на тестовом планшете, каждая лунка содержала 180 мкл CAMHB или HTM. Эти добавки представляли собой 10-кратное разведение тестируемых образцов, обеспечивающих получение 12 концентраций (в колонках планшета 1-12) по 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,31, 0,16, 0 , 08, 0,04, 0,02 и 0,01 мкг/мл. Каждый тестируемый образец тестировался на отдельных планшетах. Контрольный растворитель приготовлялся путем разведения 1% раствора лидокаина гидрохлорида в стерильной дистиллированной воде, как описано выше для тестируемых образцов, и тестировался в двойных рядах в отношении каждого тестируемого организма.

Оценка значений МИК

Все лунки на одном микротитровальном планшете инокулировались 10 мкл тест-организмом (один вид тест-организма на планшет), чтобы получить конечные жизнеспособные концентрацию инокулята около 104 КОЕ/мл. Инокулированные 96-луночные планшеты инкубировались при температуре 35 ± 2°С в течение 16-24 часов. После инкубации лунки каждой микротитровального планшета исследовались на наличие микробного роста (мутность) и конечную точку (МИК) для каждого тестируемого вещества, зафиксированного как самая низкая концентрация, которая полностью ингибировала рост тест-организма. Статистический анализ результатов не проводился.

Результаты

Результаты, представленные в Таблице 1 демонстрируют, что значения МИК для Цеф III® были идентичны значениям МИК для оригинального препарата цефтриаксона в отношении большинства организмов, тестируемых в данном исследовании, измеренных как 0,04 мкг/мл для Klebsiella pneumoniae NCTC 7427, 0.08 мкг/мл для Haemophilus influenzae ATCC 49247, 0,16 мкг/мл для Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 и Escherichia coli ATCC 25922, 2,5 мкг/мл для Staphylococcus aureus ATCC 25923 и 10,0 мкг/мл для Pseudomonas aeruginosa ATCC 41501.

Было отмечено одно исключение, когда значение МИК Цеф III® 2,5 мкг/мл в отношении Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 (ESBL) было ниже МИК оригинального препарата цефтриаксона на 5 мкг/мл в отношении этого тест-организма. Однако, было отмечено, что роцефин вызывает снижение роста этого тест-организма на 2,5 мкг/мл.

Таблица 1 Значения МИК Цеф III® и оригинального препарата цефтриаксона в отношении аэробных бактерий

Примечание: *Снижение роста наблюдалось при 2,5 мкг/мл

Обсуждение

Используя метод разведений в бульоне, мы обнаружили, что Цеф III® иоригинальный препарат цефтриаксона продемонстрировали ту же активность, выраженную через значения МИК против ряда аэробных бактерий. Было отмечено единственное исключение, когда образцы были протестированы на ESBL-продуцирующем штамме Klebsiella pneumoniae. Мы сравнили наши данные с результатами экспериментальных исследований Цефтриаксона (Ro 13-9904), выполненных на клинических изолятах Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenza, Escherichia coli и видов Klebsiella (Таблица 2).

Table 2 Значения МИК Цеф III® или оригинальный препарат цефтриаксона, сопоставимые со значениями МИК Цефтриаксона (Ro 13-9904) из пробных исследованиях

Примечание: ND – нет данных; * – данные, представленные для неизвестных видов Klebsiella.

Как видно из Таблицы 2, значения МИК Цеф III® и оригинального препарата цефтриаксона, выявленные в нашем исследовании, были весьма сопоставимыми [3,16-18].[3,16–18]. Verbist с соавт. (1981) определил МИК Цефтриаксона (Ro 13-9904) в диапазоне 0,015-4 мкг/мл в отношении Цефалотин-резистентных видов Klebsiella, что также соответствует нашим результатам, полученным на ESBL-продуцирующем штамме Klebsiella pneumoniae. [16]. Несмотря на то, что оригинальный препарат цефтриаксона уменьшал рост этого тест-организма на 2,5 мкг/мл, его МИК была в два раза выше, чем значение МИК Цеф III® (2,5 мкг/мл против 5 мкг/мл соответственно). Таким образом, мы можем предложить равную in vitro эффективность оригинального препарата цефтриаксона и его дженерика Цеф III®.

Вывод

Антибактериальная активность, продемонстрированная Цеф III®, выраженная через значения МИК в отношении ряда аэробных бактерий, была напрямую сопоставима с антибактериальной активностью, продемонстрированной оригинальным препаратом цефтриаксона в отношении тех же штаммов аэробных бактерий в данном исследовании.

Вклады авторов

[Allegra. E, Carter, J.N  - Отделение клеточной и молекулярной науки, ENVIGO CRS Ltd., Алконбери, Кембриджшир, Соединенное Королевство)]

Заявление о конфликте интересов

Авторы удостоверяют, что у них нет никаких возможных конфликтов интересов, связанных с публикацией текущей работы.

Финансирование

Исследование финансировалось X7 Research Co. Ltd. (Санкт-Петербург, Российская Федерация).

Список литературы

1. Принципы Фойя в области медицинской химии. 7-е изд. / изд.. Foye W.O., Lemke T.L., Williams D.A. Филадельфия: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, 2013. 1500 стр.
2. Fuda C. с соавт. Механистическая основа для действия новых антибиотиков цефалоспорина, эффективных против метициллин- и ванкомицин-резистентного Staphylococcus aureus // J. Biol. Chem. 2006. Том 281, № 15. Стр. 10035–10041.
3. Angehrn P. с соавт. Ro 13-9904, цефалоспорин длительного действия и широкого спектра: исследования in vitro и in vivo // Antimicrob. Agents Chemother. 1980. Том 18, № 6. Стр. 913–921.
4. Регистрационное удостоверение на лекарственный препарат Зибан, Медокеми Лтд, Кипр; № РК-ЛС-5№022924 от 18.04.2017. Государственный реестр лекарственных средств Республики Казахстан.
5. Базовая и клиническая фармакология. 12-е изд. / изд. Katzung B.G., Masters S.B., Trevor A.J. Нью-Йорк: McGraw-Hill Medical, 2012. 1229 стр.
6. Государственный реестр ЛС, ИМН и МТ Республики Казахстан [Электронный ресурс]. URL: http://www.dari.kz/category/search_prep (accessed: 21.10.2017).
7. Тесты для определения чувствительности аэробных бактерий к антимикробным препаратам с помощью метода разведения, для бактерий, 10-е издание. Место публикации не определено: Clinical And Laboratory S, 2015.
8. Sherwood T. Дженериковые препарата. Центр оценки и исследований лекарственных средств, Управление США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств.
9. Экономия благодаря дженериковым препаратм в Вашингтоне, округ Колумбия: Фармацевтическая ассоциация дженериков (GPhA). 2015.
10. Gallelli L. с соавт. Безопасность и эффективность дженерических препаратов в отношении лекарственной формы бренда // J. Pharmacol. Pharmacother. 2013. Том 4, № 5. Стр. 110.
11. Schito G.C., Keenan M.H.J. Прогнозирование клинической эффективности дженериковых лекарственных форм цефтриаксона // J. Chemother. Флоренция, Италия. 2005. Том 17 Suppl 2. Стр. 33–40.
12. Moet G.J. с соавт. Расширенные исследования лекарственных форм пиперациллина/тазобактама: изменения между партиями брендовых препаратов и оценка 46 партий дженериков // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2009. Том 65, № 3. Стр. 319–322.
13. Silva E. с соавт. Сравнительное исследование in vitro антимикробной активности различных коммерческих антибиотиков для внутривенного введения // BMC Clin. Pharmacol. 2010. Том 10, № 1.
14. Lowman W. с соавт. Сравнительная оценка МИК дженерикового цефтриаксона методом микроразведений в бульоне на клинически значимых изолятах из академического больничного комплекса в Южной Африке // South Afr. Med. J. Suid-Afr. Tydskr. Vir Geneeskd. 2012. Том 102, № 2. Стр. 102–103.
15. Jones R.N., Fritsche T.R., Moet G.J. Оценка in vitro мощности различных препаратов пиперациллина/тазобактам по сравнению с современными брендовыми (Zosyn, Wyeth) препаратами // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2008. Том 61, № 1. Стр. 76–79.
16. Verbist L., Verhaegen J. Активность in vitro Ro 13-9904, нового цефалоспорин стабильного к бета-лактамазе // Antimicrob. Agents Chemother. 1981. Том 19, № 2. Стр. 222–225.
17. Shannon K. с соавт. Антибактериальная активность in vitro и чувствительность цефалоспорина Ro 13-9904 к бета-лактамазам // Antimicrob. Agents Chemother. 1980. Том 18, № 2. Стр. 292–298.
18. Neu H.C., Meropol N.J., Fu K.P. Антибактериальная активность цефтриаксона (Ro 13-9904), цефалоспорина, стабильного к бета-лактамазе // Antimicrob. Agents Chemother. 1981. Том 19, № 3. Стр. 414–423.